Největší naděje i současné úspěchy GT jsou spojovány s terapií zhoubných nádorů. Je to dáno tím, že ke zničení buněk postačuje často jen krátkodobá exprese vneseného genu. Navíc etické problémy, které s sebou GT přináší, jsou u onkologických nemocných méně vyjádřené.
Gen, který se přenáší (tzv. transdukce), se nazývá transgen. Přenos se může dít pomocí zvláštních přenašečů, nazývaných vektory.
Transdukce se může dít fyzikálními, chemickými metodami nebo pomocí virových vektorů. Mezi fyzikální metody patří (22) vpravení nahé DNA (plazmidů obsahujících transgen) mikroinjekcí, elektroporací nebo pomocí genové pistole vystřelující částice zlata obalené DNA. Principem chemických metod je vazba různých molekul na DNA, které usnadňují transdukci. Patří sem kupř. lipofekce, kdy jsou přenašečem částice lipidů (liposomy), které splývají s buněčnou membránou, vnikají do buňky a po degradaci v lysosomech se DNA uvolňuje, přesunuje do jádra, kde se může integrovat s buněčným genomem. Užívají se ale i další látky s navázanou DNA, umožňující vazbou na specifické receptory vstup přenášené DNA. Nevýhodou fyzikálních a chemických metod je nízká účinnost transdukce a menší pravděpodobnost, že dojde k integraci do buněčného genomu, výhodou je, že chybí limitace velikosti přenášené DNA.
Nejužívanější metodou transdukce je v současnosti užití defektních virových vektorů. Pronikání do buněk je virům vlastní, jejich účinnost v přenesení genetického materiálu do buňky je tedy vysoká. Proces spojení transgenu s virovým genetickým materiálem se nazývá rekombinace. Rekombinovaný genom je zavzat do virového obalu. Virové vektory jsou připravovány v speciálních buněč-ných liniích, aby nebyly schopny samostatné replikace. Nevýhodou virových vektorů je jejich nízká schopnost pojmout větší molekuly DNA, dále imunogenost některých virových faktorů, zkracující dobu exprese a snižující účinnost tohoto způsobu transdukce. S naprostou jistotou nelze vyloučit ani možná biologická rizika, která by s sebou vpravení virů mohla přinést.
V kardiologii se GT zaměřuje na tři hlavní oblasti. Jde o novotvorbu cév, srdeční selhání a snahu zabránit reokluzi po provedené perkutánní transluminální intervenci. 47 % kardiologických studií zaměřených na GT užívalo nevirové vektory - v 39 % nahou DNA (tedy plazmidy obsahující transgen), v 8 % liposomové prenašeče (7). Využito bylo především vektoru kódujícího růstový faktor cévního endotelu.
Teprve později bylo užito virových vektorů, od nichž se očekávala výraznější a delší exprese genu. V kardiologicky zaměřených studiích bylo užito výlučně adenovirů. Není však příliš pravděpodobné, že tento vektor bude úspěšný v širším měřítku i v humánní medicíně. Důvodem je limitované trvání exprese genu, problémy s jeho opakovaným podáním pro vznik neutralizačních protilátek proti adenovirům u většiny (4) nebo dokonce všech nemocných (14).
Zatím máme k dispozici pouze výsledky studií fáze I, které byly zaměřeny především na bezpečnost podání a teprve později a v menší míře na efekt terapie samotný. Prvou a pravděpodobně nejdůležitější oblastí u ICHS je posílení novotvorby cév - tzv. terapeutická angiogeneze (17). Může se uplatnit především u těžkých ischemických postižení myokardu s refrakterní anginou pectoris a s nemožností provést úplnou revas-kularizaci chirurgickou nebo katetrizační cestou (podobně se to týká ischemických syndromů na dolních končetinách). Zahrnují se sem i stavy s postižením periferních oblastí koronárního řečiště, kterým nejsme schopni podstatnějším způsobem pomoci již zaběhnutými revaskularizačními metodami.
První důkaz o účinnosti GT při angioneogenezi byl v experimentu podán v roce 1994 Takeshitou (17), v humánní kardioangiologii pak Isnerem o něco později (6). Tyto práce odpovídají již dříve publikovaným zjištěním, že sval, především pak ischemický, velice ochotně přijímá plazmidy DNA, nejspíše pro svou mnohojadernou strukturu (24). Problémem není ani intramyokardiální podání intraoperační z epikardiálního přístupu. Déletrvající exprese genu, která se předpokládá u některých genetických poruch, se nejeví jako zásadní požadavek u GT s cílem neovaskularizace myokardu (7). Bezpečnostní profil přechodné exprese genu byl ověřován v řadě studií zabývajících se ischémií myokardu. Jak bude uvedeno níže, z 85 nemocných po transferu genu pomocí plazmidu byla zaznamenána tři úmrtí. V průběhu 1-3letého sledování 97 nemocných s užitím adenovirového vektoru došlo k pěti úmrtím, což odpovídá více než 1000 pacientů léčených konvenčně medikamentózní terapií nebo laserovou revaskularizací (1).
Po intraarteriálním podání plazmidu DNA kódujícího růstový faktor cévního endotelu (vascular endotelial growth factor, VEGF) došlo k zlepšení krevního zásobení ischemické končetiny. Plazmid byl zaveden do distální popliteální tepny s pomocí angioplastického balonku. Vymizely klidové ischemické bolesti a po měsíci bylo možno angiograficky prokázat zmnožení kolaterálního řečiště v oblasti kolena, části hlezenní kosti a kotníku. Přestože se po pěti měsících ukázalo, že je nutno amputovat končetinu pro již rozvinutou gangrénu, staly se Isnerovy práce podnětem k zahájení dalších pokusů. Za dva roky poté byla publikována studie využívající rovněž plazmid kódující VEGF, který byl aplikován intramuskulárně u 9 nemocných s kritickou ischémií dolní končetiny (2). Došlo k významnému zvýšení plazmatických koncentrací VEGF, zlepšení distálního průtoku u 8 z 10 končetin hodnoceného MR angiografií, zlepšení nebo vyhojení ischemických vředů u 4 ze 7 nemocných. Proliferace endotelových buněk byla prokázána po 10 týdnech v oblastech s aplikovaným genem.
První randomizovaná studie zabývající se intramyokardiálním podáním plazmidu kódujícího VEGF byla publikována Losordem a spolupracovníky v roce 1998 (9). U 5 nemocných se symptomatickou refrakterní anginou pectoris aplikovali z levé přední torakotomie uvedený plazmid přímo do ischemického myokardu. Pomocí radioizotopů (SPECT) bylo ve všech případech po 30 a 60 dnech prokázáno zlepšení ischémie, zvýšení kolaterálního průtoku, nebyly zaznamenány žádné nežádoucí příznaky v experimentální ani humánní medicíně. Podobná studie (16) se věnovala podání plazmidu kódujícího VEGF u 30 nemocných. U 29 z nich došlo k zlepšení anginy pectoris a snížení spotřeby nitroglycerinu. V horizontu šestiměsíčního sledování 20 z nich dokonce anginózní obtíže vymizely u 12 a dále u 7 z 10 sledovaných po dobu jednoho roku. Významně se prodloužila doba tolerované zátěže při testech užívajících Bruceova protokolu,
u 14 nemocných došlo k zvýšení ejekční frakce alespoň o 5 %,
u 16 zbývajících nedošlo ke změnám uvedeného ukazatele kontrakcí.
Z 30 Isnerových nemocných (7), kterým byla intramyokardiálně podána nahá DNA kódující VEGF-2 pro těžkou anginu pectoris (třídy III a IV dle CCAC), 29 přežívá po dobu jednoho roku a nikdo z nich nemusel podstoupit srdeční transplantaci, k jedinému úmrtí došlo 20 hodin po operaci. U většiny z nemocných nastalo zlepšení anginy pectoris a prodloužení zátěžového času.
Výše uvedené studie však byly omezeny užitím fyzikální metody transdukce - podání plazmidů, jejichž účinnost pro přenos genu je malá, jsou vychytávány většinou buněk a nejsou chráněny proti buněčným obranným mechanismům. Transdukce takto provedená se ukázala sice jako bezpečná, ale má pouze časově omezenou působnost. Stále není zcela jasné, jaký růstový faktor by se měl přenášet, jaká je optimální dávka, cesta podání a další (3). Proto v dalších studiích byla dána přednost virovému vektoru, pomocí něhož lze dosáhnout vyššího titru genových produktů. V studii Rosengarta a spol. (14) byl užit jako vektor adenovirus s VEGF, který byl u 21 pacientů aplikován injekčně přímo do oblasti reverzibilní ischémie myokardu jako doplněk aortokoronárního bypassu nebo z minitorakotomie. U všech nemocných došlo po 30 dnech k symp-tomatickému zlepšení, které se potvrdilo u většiny z nich i radioizotopovými metodami a koronarograficky. Nejvýhodnější se ukázal revaskularizační operační zákrok v kombinaci s GT, u nemocných se samotnou GT došlo k zlepšení zátěžové ischémie jen u poloviny z nich. Nebyly zaznamenány žádné podstatnější nežádoucí příznaky.
V dalších studiích se pak výzkumníci zaměřili na genetický přenos některých jiných růstových faktorů, např. základní růstový faktor fibroblastů (basic fibroblast growth factor, bFGF), jehož užití vypadá slibně.
Udelson (18) podal intrakoronárně nebo intravenózně rekombinantní růstový faktor pro fibroblasty (recombinant fibroblast growth factor, rFGF) 59 nemocným s refrakterní anginou pectoris. Po 180 dnech zaznamenal zlepšení ischémie v klidu i po zátěži radionuklidovými metodami - SPECT. Celková ejekční frakce se nezměnila, ve studii nebylo užito placeba.
Zcela nový přístup užili japonští autoři (12), když použili jaterní růstový faktor (HGF), přenesený ovšem intramuskulární injekcí plazmidu HGF. U transgenních myší došlo k výraznému efektu angiogeneze se zvýšením průtoku a kapilární denzity na dolních končetinách.
Aby bylo možno přesněji posoudit vliv placeba, byla zorganizována studie AGENT (Adenovirus GENe Therapy) jako randomizovaná, dvojitě slepá studie genové terapie kontrolovaná placebem (4). Studie obsahovala 79 nemocných s anginou pectoris třídy CCSC II-III, ischémií prokázanou zátěžovým testem a významnou koronární nemocí prokázanou koronarograficky. 60 pacientům byl rekombinantní adenovirus 5 FGF-4 aplikován intravenózní injekcí, u 19 bylo užito placeba. Při zátěžovém vyšetření po
4 a 12 týdnech bylo prokázáno významně delší prodloužení zátěžového času (o více než 30 %), výrazné zlepšení bylo však prokázáno i v placebové skupině.
Nedávno byla publikována pilotní studie s perkutánním transferem genu pomocí katetru, studie byla randomizovaná, jednoduše slepá - obsahovala celkem 6 nemocných s anginou pectoris, 3 z nich byli v placebové skupině (19). Během prvních 30 dnů nebyl rozdíl ve výskytu anginy pectoris mezi oběmi skupinami (u obou došlo k jeho poklesu), což ukazuje na nezanedbatelný vliv placeba. Během
90 dnů však došlo k snížení počtu anginózních záchvatů pouze v léčené skupině, v níž bylo možno neivazívně prokázat zlepšení perfúze myokardu. Tato studie se stala východiskem pro další multicentrickou, randomizovanou, dvojitě slepou kontrolovanou placebem, u níž bylo užito rovněž transkatetrového přenosu genu pro VEGF-2 u 19 nemocných; její výsledky byly nedávno publikovány a jeví se jako velmi slibné (9). Některé poslední studie, splňující současné přísné požadavky, však nevyzněly pro GT u ICHS zcela přesvědčivě. Týká se to kupř. studie FIRST (15), v níž po intrakoronárním bolusovém jednoduše slepém randomizovaném podání růstového faktoru-2 fibroblastů (FGF Initiating RevaScularization Trial) došlo jen k velmi nepřesvědčivému symptomatickému zlepšení bez ovlivnění i jen zátěžové tolerance.
Ve stadiu intenzivního výzkumu je i užití GT u srdečního selhání. Zvýšení kontraktility se děje (1) modulací homeostázy kalcia, (2) ovlivněním beta-adrenergních receptorů a konečně zvýšením odolnosti kardiomyocytů k apoptóze.
Modulace homeostázy kalcia vychází z dříve již známých poznatků o tom, že zvýšení aktivity Ca-ATPázy sarkoplazmatického retikula (SERCA) vede k vzestupu koncentrací cytozolického kalcia a tím jeho nižší dostupnosti pro uvolňování ze sarkoplaz-matického retikula. Pomocí experimentálních dat na krysách bylo prokázáno, že adenoviry zprostředkovaný transfer genu pro SERCA2a zlepšuje systolickou i diastolickou funkci levé komory u krys, u nichž bylo srdeční selhání vyvoláno tlakovým přetížením levé komory. Po uvedené expresi SERCA2a došlo k zmenšení velikosti levé komory a poměru telesystolického tlaku a rozměru (11).
„Downregulace“ beta-adrenergních receptorů (BAR) spolu s „upregulací“ kinázy BAR jsou u srdečního selhávání známým nálezem. Intrakoronární aplikace adenoviry přeneseného genu pro BAR vede u králíků k zvýšení kontraktility, které přetrvává
3 týdny. Weig (23) aplikoval transkoronárně gen působící expresi vazopresinových receptorů, které vedou podle dřívějších zjištění k zvýšení aktivace adenylcyklázy, čímž obešel BAR. U krysích a králičích srdcí prokázal zvýšení frakcionovaného zkrácení a dP/dTmax levé komory.
Nepříznivý vliv apoptózy u nemocných se srdečním selháváním byl prokázán již v minulosti, genový přenos vedoucí k antiapoptóze, tedy delšímu přežití buněk, představuje velkou naději pro tyto nemocné (5).
Třetí potenciální aplikací GT je prevence restenózy po PTCA. Bylo ukázáno, že rozvoj restenózy může souviset s hladinami syntetázy kysličníku dusnatého a jejím substrátem - L-argininem. Přenos genu pro NO-syntetázu může snižovat neointimální proliferaci, která je podkladem restenózy, příznivě působí i podávání samotného L-argininu (20). Kromě přenosu genu pro NO-syntetázu byly prokázány slibné účinky v prevenci restenózy transdukce genu thymidinkinázy, tkáňového inhibitoru metaloproteináz a některých dalších (25).
Po PTCA dochází také k aktivaci tzv. tkáňového faktoru (TF) jako iniciátoru koagulace a trombózy v místě poraněné tepny (jakož i v ateroskleroticky zúžených oblastech arteriálního řečiště). Po dávání rekombinantního inhibitoru TF snižuje intimální hyperplazii. Adenovirový genetický transfer uvedeného inhibitoru snížil intimální hyperplazii o 43 % (26). Příznivý efekt na vznik budoucí restenózy může být patrný i po výkonech na nejrůznějších periferních tepnách.
Z dalších možných nadějí GT u kardiovaskulárních chorob přichází v úvahu konverze myocytů komorového myokardu do pacemakerových buněk pomocí genu kódujícího kaliový kanál (10). Určitou míru optimismu přináší GT i u systémové i plicní hypertenze.
GT představuje v kardiologii nepochybně velkou naději, především v léčbě ischemických postižení. Z výsledku studií fáze I se začíná rýsovat skutečné využití GT v klinické medicíně. Vzhledem k nedostatku randomizovaných, placebem kontrolovaných studií však stále nejsme zatím schopni efekt této terapie zodpovědně posoudit, neboť není jednoznačně jasné, zda lze zlepšení perfúze myokardu přičíst pouze angiogenezi. Mezi největší otazníky patří výběr optimálního vektoru, zajišťujícího vysokou účinnost bez toxicity. V kardiologicky laděných studiích se pozornost pravděpodobně více zaměří na jiné než adenovirové vektory (AA-viry, lentiviry). Otazníkem je i optimální cesta vpravení genetického materiálu (intravenózní, intrakoronární, intramyokardiální podání nebo nejpravděpodobněji kombinace dvou přístupů, především kardiochirurgického s transmyo-kardiální aplikací, která by se doplnila o intravenózní přístup). Neznámou stále zůstává i otázka dávky. Dosavadní výsledky ukazují, že GT je dobře tolerována, je bezpečná, a nyní by měla následovat éra randomizovaných, placebem kontrolovaných studií, s nimiž se již v některých zemích začalo.

III. interní-kardiologická klinika, Kardiocentrum, 3. LF UK
a FNKV, Praha

Literatura:
1. Allen KB. Comparison of transmyocardial revascularization with medical therapy in patients with refractory angina. A Engl J Med 1999:341:1029-36.
2. Baumgartner I, Pieczek A, Manor O et al. Constitutive expression of ph VEGF 165 after intramuscular gene transfer promotes collateral vessel development in patients with critical limb ischemia. Circulation 1998:97:1114-23.
3. Freedman SB, Isner JM. Therapeutic angiogenesis for coronary artery disease. Ann Intern Med 2002:136:54-71.
4. Grines CL, Watkins MW, Helmer G et al. Angiogenic GENe Therapy (AGENT) trial in patients with stable angina pectoris. Circulation 2002:105:1291-7.
5. Hausetter A, Izumo S. Toward antiapoptosis as a new treatment modality. Circ Res 2000:86:371-6.
6. Isner JM, Pieczek A, Schainfeld R et al. Clinical evidence of angiogenesis after arterial gene transfer of ph VEGF 165 in patient with ischaemic limb. Lancet 1996:348:370-4.
7. Isner JM. Myocardial gene therapy. Nature 2002:415:234-9.
8. Laham RJ, Sellke FW, Edelman ER et al. Local perivascular delivery of basic fibroblast growth factor in patients undergoing coronary bypass surgery: results of a phase I randomized, double-blind, placebo-controlled trial. Circulation 1999:100:1865-71.
9. Losordo EW, Vale PR, Hendel RC et al. Phase 1/2 placebo-controlled, double-blind, dose-escalating trial of myocardial vascular endothelial growth factor 2 gene transfer by catheter delivery in patients with chronic myocardial ischemia. Circulation 2002:105:20012-8.
10. Marb E. Gene therapy converts myocytes to pacemaker cells. Nature 2002:419:132-3.
11. Miyamoto MI et al. Adenoviral gene transfer of SERCA2a improves left ventricular function in aortic-banded rats in transition to heart failure. Proc Natl Acad Sci USA 2000: 97: 793-8.
12. Morishita R, Sakaki M, Yamamoto K et al. Impairment of collateral formation in lipoprotein transgenic mice - Therapeutic angiogenesis induced by human hepatocyte growth factor gene. Circulation 2002:105:1491-6.
13. Periasamy M. Adenoviral mediated-SERCA gene transfer into cardial myocytes. How much is too much? Circulation 2001:88:373-5.
14. Rosengart TK, Lee LY, Patel SR et al. Angiogenesis gene therapy: phase 1 assessment of direct intramyocardial administration of an adenovirus vector expressing VEGF121 cDNA to individuals with clinically significant severe coronary artery disease. Circulation 1999:100:468-74.
15. Simons M, Annex BH, Kleiman A et al. Pharmacological treatment of coronary artery disease with recombinant fibroblast growth factor-2. Double-blind, randomized, controlled clinical trial. Circulation 2002:105:788-93.
16. Symes JF et al. Gene therapy with vascular endothelial growth factor for inoperable coronary artery disease: preliminary clinical results. Ann Thor Surg 1999:68:830-7.
17. Takeshita S, Isschiki T, Sato T. Therapeutic angiogenesis: a single intra-arterial bolus of vascular endothelial growth factor augments revascularization in a rabbit ischemic hindlimb model. J Clin Invest 1994:93:662-70.
18. Udelson JE, Dilsizian J, Laham RJ et al. Therapeutic angiogenesis with recombinant fibroblast growth factor-2 improves stress and rest myocardial perfusion abnormalities in patients with severe symptomatic chronic coronary artery disease. Circulation 2000:102.1605-10.
19. Vale PR, Losordo DW, Milliken CE et al. Left ventricular electromechanical mapping to assess efficacy of phVEGF(165) gene transfer for therapeutic angiogenesis in chronic myocardial ischemia. Circulation 2000:102:965-74.
20. Vermeersch P, Nong Z, Stabile E et al. L-arginine administration reduces neointima formation after stent injury in rats by a nitric oxide-mediated mechanism. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2001:21:1604-9.
21. Vincent KA et al. Angiogenesis is induced in rabbit moddel of hindlimb ischaemiea by naked DNA encoding a HIF-1alfa/VP16 hybrid transcription factor. Circulation 2000:102: 2255-61.
22. Vonka V. Genová terapie. Postgrad.Med. 2002:...: 563-8.
23. Weig HJ et al. Enhanced cardiac contractility after gene transfer of V2 vasopressin receptors in vivo by ultrasound-guided injection of transcoronary delivery. Circulation 2000:101:1578-85.
24. Wolf JA. Direct gene transfer into mouse muscle in vivo. Science 1990:247:1465-8.
25. Yla-Herttuala S, Martin JF. Cardiovascular gene therapy. Lancet 2000:355:213-22.
26. Zoldelyi P, Chen ZQ, Shelat HS et al. Local gene transfer of tissue factor pathway inhibitor regulates intimal hyperplasia in atherosclerotic arteries. Proc Natl Acad Sci USA 2001:98:4078-83.
27. Zuckerbraun BS, Tzeng E. Vascular gene therapy - A reality of the 21st century. Arch Surg 2002:137:854-61.