Programovaná buněčná smrt
Programově řízená buněčná smrt je označovaná řeckým termínem apoptóza, který se dá volně přeložit jako „opadávání“. Poprvé použili toto označení v roce 1972 Kerr a spol., ale teprve koncem 80. let došlo k intenzivnímu integrovanému vědeckému bádání v této do té doby opomíjené oblasti. Ukázalo se, že řízená smrt buňky je ve své podstatě fyziologickým procesem, který se uplatňuje po celou dobu života. V období embryonálního vývoje zodpovídá například za tvorbu prstů nebo tělních dutin plodu, po narození pak za přestavbu fetální cirkulace a v průběhu života za cyklické změny během reprodukčního cyklu ženy nebo za eliminaci nadbytečných aktivovaných T a B lymfocytů. Apoptózu však mohou aktivovat také některé negativní vlivy zevního prostředí (toxické chemikálie, ionizující záření, tepelný šok, hypoxie), které buňku závažněji poškozují, ale bezprostředně nevedou k její okamžité smrti. V takovém případě je apoptózu smrtí patologickou, na rozdíl od nekrózy si však zachovává svůj geneticky řízený, programovaný charakter a zůstává aktivním procesem vyžadujícím energii.

Programově umírající buňka má morfologické i biochemické charakteristiky, které ji zásadně odlišují od buněčné nekrózy. Při apoptóze dochází ke smršťování buňky, kondenzaci a hrudkování chromatinu jádra, vytváření povrchových „puchýřků“ následované fragmentací buňky na apoptotická tělíska. Zbytky odumřelé buňky jsou kanibalisticky pohlceny okolními buňkami. Není však poškozena okolní tkáň, a proto nedochází k zánětlivé reakci. Biochemicky již v časné fázi apoptózy prokazujeme pravidelnou fragmentaci jaderné deoxyribonukleové kyseliny (DNK), kterou lze zachytit metodou gelové elektroforézy jako pravidelné proužky - tzv. „žebříčkové“ fragmenty DNK.

Naproti tomu neřízená smrt buňky - nekróza - se od apoptózy zásadně odlišuje. Nekróza je reakcí na akutní, neopravitelné buněčné poškození, způsobené například anoxií. Představuje náhodnou, neprogramovanou, tj. geneticky neřízenou smrt. Dochází k zástavě oxidativní fosforylace a v důsledku otevření iontových kanálů k nahromadění sodných a vápenatých iontů v buňce. To vede k edému buňky s následnou rupturou membrán organel a uvolnění proteolytických enzymů do cytoplazmy. Dochází k neorganizovanému štěpení bílkovin a DNK. Nakonec je degradována i zevní buněčná membrána a obsah buňky se vylévá do okolí. Spouští se tím zánětlivá kaskáda se všemi nežádoucími důsledky pro okolní tkáň. Na poškození tak buňka může reagovat několika způsoby. O tom, k jakému typu buněčné odpovědi dojde, rozhoduje síla postižení a rychlost, s jakou k němu došlo, ale i aktuální stav buňky. Při mírnějším poškození reaguje buňka poruchou proliferace ve smyslu minus (zástava dělení), může však dojít i k nekontrolované proliferaci a vzniku maligních buněk. Jinou reakcí je změna buněčného metabolismu, především syntéza tzv. stresových proteinů, které zahajují adaptační reakci buňky, ve světelném mikroskopu jde o změny označované jako tkáňová dystrofie. Na závažné postižení reaguje buňka apoptotickou smrtí (tkáňová numerická atrofie) nebo nekrózou.

Buněčná sebevražda, její vnitřní a vnější signální cesta
Celý proces apoptózy je geneticky kódován a složitě, vícestupňově řízen. Účastní se ho řada genů a jimi regulovaných bílkovinných cytoplazmatických a membránových makromolekul, označovaných složitými zkratkami a mnohdy poetickými názvy (DIABLO protein). V dalším textu nebudou pro zjednodušení podrobně vysvětlovány všechny použité zkratky původně anglických termínů a pro podrobnější studium odkazuji na přehledové články uvedené v literatuře.

Apoptóza se zahajuje vždy signální fází, která představuje ještě „vratnou fázi“ apoptotické kaskády a během níž je ještě možné buněčné smrti zabránit. Proces programované smrti může být spouštěn buď tzv. vnější cestou - stimulací specifických receptorů smrti na povrchu buňky a uvolněním či aktivací některých specifických proteinů (Bax, DISC) -, nebo vnitřní cestou, v níž centrální roli hrají protein p53 a mitochondrie. Apoptóza je dále regulována lokálními cytokiny (interferon-gama, interleukin-1 beta, TNF-alfa, růstové faktory) a modulována například steroidy, vazoaktivními působky, jako je oxid dusnatý, nebo některými neurotransmitéry. Je zajímavé, že geny regulující konečnou společnou cestu buněčné smrti jsou fylogeneticky velmi staré a některé proteiny se zásadně neliší například u hlístů a u člověka.

Vnitřní signální cesta
Vnitřní cesta je aktivována poškozením jaderné DNK vlivem metabolitů, volnými kyslíkovými radikály, ischemií, virovou infekcí buňky nebo jinými toxiny. Klíčovou roli zde hraje gen p53 a jím kódovaný stejnojmenný protein, jehož hlavní funkcí je rozpoznat genetické poškození, iniciovat a katalyzovat jeho opravu. Současně je inhibováno dělení buňky do doby, než je poškození opraveno. Pokud však protein p53 odhalí změny DNK přesahující možnost opravy, zvýší se jeho exprese a indukuje syntézu dalších proteinů, které poškozují mitochondrie. Mitochondrie, které za normálních okolností zajišťují energetický metabolismus buňky, ztrácejí membránový potenciál a dochází ke zvýšení propustnosti membrány pro látky aktivující apoptotické děje. Z mitochondrií je uvolněn cytochrom c, Diablo protein, a apoptózu indukující protein (AIP) a další proteiny, které již zahajují aktivaci kaspáz. Současně se zvyšuje tvorba volných kyslíkových radikálů, která mitochondrie dále poškozuje a zvyšuje uvolňování výše uvedených proteinů. Tím končí signální fáze apoptotického procesu a zahajuje se její nevratná část - aktivace kaspázové kaskády.

V celém procesu vnitřní cesty mají důležitou roli i mechanismy antiapoptotické a jejich vzájemný poměr určuje výsledný stav. Nejlépe prozkoumaný je antiapoptogenní protein Blc-2 nalezený v B buňkách maligního lymfomu (B lymfoma cells protein), který se nachází především v mitochondriách. Je-li Blc-2 přítomen v dostatečné koncentraci, blokuje efekt proteinu p53 a chrání mitochondrie před poškozením.

Vnější signální cesta
Vnější cesta je někdy nazývána cestou přes receptor smrti. Zahajuje se navázáním ligandu na receptor smrti, což je skupina povrchových receptorů buněčné membrány z rodiny Tumor Necrosis Factor TNF-alfa (označovaná jako Fas, TNFR-1). Touto cestou probíhá apoptóza například při destrukci buněk malignizovaných nebo napadených virovou infekcí. Obsazení receptoru ligandem aktivuje smrtící doménu v blízné cytoplazmě a dochází k aktivaci kaspázové kaskády. I v této cestě má protektivní úlohu již zmíněný Bcl-2 protein, který ještě může celý proces apoptózy v tomto kroku zablokovat.
 
Když padne nezvratné rozhodnutí
Signální fáze apoptózy je ukončena aktivací proteinů zodpovědných za proteolytickou degradaci intracelulárních proteinů, nazývaných kaspázy. Název vznikl z anglické zkratky cystein aspartases a označuje skupinu cysteinových proteáz hydrolyzujících proteiny na specifických místech. Kaspázy mají klíčový význam v celém procesu apoptózy a jejich aktivace zahajuje vlastní exekutivní (rozkladnou) fázi apoptózy. Tento okamžik představuje bod, z něhož již není návratu (v angličtině „point of no return“). Právě nyní se buňka nezvratně rozhoduje o spáchání sebevraždy a jejím vykonání. Protože jde o zásadní rozhodnutí, je i tento proces složitě řízen: předně jsou kaspázy syntetizovány jako neaktivní molekuly (tzv. prokaspázy), které se pro výkon své funkce musejí aktivovat výše uvedeným signálním procesem. Avšak ještě před zahájením kaskády aktivačních reakcí a i v jejím průběhu může být celý proces zastaven například proteinem inhibujícím apoptózu (IAP= Inhibitors of Apoptosis), který zabraňuje aktivaci prokaspázy 3, nebo proteinem FLIP zabraňujícím aktivaci prokaspázy 8. Kaspázy působí na stovky buněčných substrátů a jejich aktivity mají pro buňku smrtící důsledky:
. inaktivují enzymy opravující
poškozenou DNK (například poly-adenosin-ribozo-polymeráza, tzv. PARP) a ukončují opravu genového poškození,
. aktivují endonukleázy štěpící
jadernou DNK na menší fragmenty,
. degradují membrány buněčných
organel (včetně mitochondriální) i zevní membránu buňky,
. hydrolyzují buněčné proteiny
a degradují i cytoskeletální struktury.
Tyto změny mají obraz v typické biochemické i morfologické změně odumírající buňky, jak bylo popsáno výše, a v konečném důsledku končí její smrtí.

Teorie stárnutí a role apoptózy
Touha po nesmrtelnosti a elixíru mládí je stará jako lidstvo samo. Tajemný, až mystický proces stárnutí a umírání přitahoval odedávna pozornost vědců a filozofů, kteří se pokoušeli odhalit příčiny stárnutí, jeho mechanismy a zákonitosti, ale především zpomalit jeho průběh. Teorie stárnutí založené na vědeckých pozorováních buněčné morfologie či chemické struktury bílkovin pocházejí již z 19. a první poloviny 20. století. Zlomovým v rozvoji vědeckého bádání byl objev nukleových kyselin, rozvoj genetických a biochemických metod a v posledních 30 letech i metod molekulární biologie.
Jedna z teorií stárnutí založená na akumulaci defektních makromolekul, především bílkovin (tzv. teorie katastrof z transkripčních chyb, postulovaná v 60. letech minulého století Orgelem), se nepotvrdila, i když v průběhu bílkovinné syntézy vzniká menší množství defektních afunkčních bílkovin. Jsou však rychle rozpoznány a rozloženy. Buněčné stárnutí nicméně s akumulací defektních proteinů přece jen souvisí. Jde však o změny, které vznikají až v období po ukončení jejich syntézy a jsou podle dnešních představ způsobené především účinkem volných kyslíkových radikálů (teorie volných radikálů). Tyto vysoce reaktivní kyslíkové molekuly nepoškozují jen bílkoviny, ale i nukleové kyseliny v jádře a mitochondriích a také lipidy v buněčných membránách. Během fylogenetického vývoje se vyvinula řada mechanismů, které vzniklá poškození v buňce opravují či přímo „neutralizují“ pro buňku nebezpečné kyslíkové radikály. V případě neopravitelného poškození tyto buněčné části likvidují. Je zřejmé, že tyto změny postihují více buňky s dlouhým životním cyklem, například buňky nervové tkáně, které se během života jedince prakticky nedělí. Na úrovni organismu a jednotlivých orgánů je proces oprav buněčného poškození složitě regulovaný a vývojem pečlivě vybalancovaný ve prospěch záchrany a přežití buněk. Přesto nelze dlouhodobě opravit všechna postižení, která se hromadí jako defektní nefunkční makromolekuly. Ty se dříve nebo později stanou signálem k zahájení sebevražedné apoptotické kaskády.

Kromě mechanismu apoptózy je délka života buňky a jedince ovlivňována jeho schopností obnovovat staré a poškozené buňky. Také tyto procesy jsou složitě regulovány. Již od 60. let je známa omezená schopnost stárnoucích buněk se dělit. Buňky získané z mladého organismu mají před sebou více replikačních cyklů než buňky ze starých dárců. V posledních letech byla podrobněji zkoumána role telomeráz, enzymů dostavujících konečné části chromozomů - teloméry, které se zkracují s každým buněčným rozdělením a u buněk v tkáňové kultuře limitují schopnost se dělit. Kultura buněk pak „stárne“, až nakonec pro neschopnost dalších dělení zcela zanikne. Výjimku tvoří tzv. „nesmrtelné“ buněčné linie z nádorů, u nichž enzym telomeráza teloméry průběžně dostavuje, což má za následek trvalou schopnost buněk se dělit a jejich nesmrtelnost v tkáňové kultuře.

Klinický význam porušené regulace apoptózy
Mohlo by se zdát, že omezení apoptotických buněčných smrtí je pro organismus výhodné, a to zejména ve stáří. Stárnutí je provázeno kromě jiných změn také úbytkem buněk a zmenšením hmoty orgánů, označované jako stařecká (senilní) atrofie. Postižena je svalová tkáň - hovoříme o sarkopenii, ubývá kostní hmoty a - zde používáme termín osteopenie či osteoporóza, dochází k úbytku hmoty mozku, srdeční tkáně i parenchymatózních orgánů, jako jsou ledviny, játra a endokrinní orgány. Důsledkem je snížení výkonnosti atrofovaných orgánů a jejich omezená schopnost zvýšit/udržet výkon při zvýšených nárocích. Teoreticky lákavá je představa, že inhibice apoptózy by mohla zabránit věkově podmíněné atrofii a udržet počet funkčních buněk na úrovni srovnatelné s mladším věkem.
Bohužel skutečnost je jiná a nálezy experimentální biologie i klinické praxe svědčí pro velmi komplikovanou, křehkou a delikátní rovnováhu mezi proapoptotickými a antiapoptotickými faktory a regulátory, jejichž nerovnováha může být příčinou některých onemocnění (tab. 1).

Inhibice apoptózy, maligní onemocnění a stárnutí
Ukazuje se, že neschopnost buněk reagovat na zevní či vnitřní fyziologické signály apoptotické regulace může mít pro organismus závažné klinické důsledky. Nejvýznamnější jsou nádorová a autoimunní onemocnění (tab. 1). Obě skupiny onemocnění mají věkovou závislost a se zvyšujícím se věkem jejich incidence stoupá. Mezi nádory, u nichž byla prokázána inhibice apoptózy, se řadí například folikulární lymfomy, hormonálně závislé nádory prostaty, prsu a vaječníků a také nádory s prokázanou mutací genu p53 (např. karcinom tlustého střeva). Teprve v posledních deseti letech jsou podrobně zkoumány mechanismy vedoucí ke snížené odpovědi buněk na apoptogenní signály. U maligních buněk byla prokázána zvýšená exprese genu Bcl-2, který brání zahájení apoptózy. U nádorových buněk prostaty, střeva a neuroblastomu bylo zvýšení exprese proteinu Bcl-2 spojeno s horší prognózou nemocných. Navíc tyto maligní buňky nereagovaly na cytostatickou léčbu.

Onkologové upozorňují na vysoký výskyt některých typů malignit u nositelů mutací genu p53. Jak již bylo uvedeno, gen p53 je senzorem poškození buněčné DNK, který jednak zabraňuje dělení poškozené buňky, jednak v případě závažnějšího poškození zahajuje kaskádu apoptotických dějů. Za normálních podmínek tak brání maligní transformaci buněk, i když může vést k předčasnému odumírání normálních či jen lehce postižených buněk. Jeho snížená funkce (například při mutaci) je spojena s vyšším výskytem nádorů a teoreticky potlačením apoptózy. V této souvislosti jsou zajímavé výsledky genetického výzkumu publikovaného vědci z molekulárně biologické laboratoře Baylor College of Medicine v Hustonu v letošním lednovém čísle časopisu Science. Myší kmen se specifickou mutací genu p53 s nadbytkem proteinu p53 se vyznačoval abnormálně nízkým výskytem nádorů ve srovnání s kmenem s obvyklou funkcí genu p53. Zde
45 % myší uhynulo na některý typ nádoru. Bohužel však mutovaný kmen myší neužíval dlouho svého beznádorového života. Jejich přežívání bylo výrazně zkráceno a již ve „středním myším věku“ vykazovaly známky stárnutí - omezení pohybové aktivity, atrofii orgánů i kůže, zhoršené hojení poranění - pravděpodobně v důsledku zvýšeného odumírání buněk. Za snížení rizika nádorů zaplatily kratším přežitím. Zdá se, že v historickém vývoji příroda dala přednost dobré protinádorové kontrole, která umožnila organismu dosáhnout reprodukčního věku ve zdraví, před dlouhým životem s rizikem maligních buněčných zvratů. Vyšší organismy včetně člověka jsou tak vybaveny dobrou antionkogenní aktivitou zabezpečovanou genem p53 pravděpodobně za cenu celkového kratšího přežívání po ukončení reprodukce. Z teoretického hlediska se zdá možné oddělení obou funkcí proteinu tak, aby při zachování antiproliferativní aktivity bylo možné potlačit jeho apoptogenní efekt. To by otevíralo možnost k delšímu přežívání buněk bez zvýšeného rizika maligní transformace.

Autoimunní onemocnění
S věkem výskyt autoimunních onemocnění narůstá. Jde zejména o zvýšenou tvorbu protilátek (nejrůznější typy gamapatií), onemocnění štítné žlázy (autoimunní tyreoiditida s následným rozvojem hypotyreózy), revmatoidní artritidu ad. Nejvíce znalostí o mechanismu inhibice apoptózy existuje pro autoimunní onemocnění - systémový lupus erytematodes. U pacientů s lupusem je snížená citlivost lymfocytů reagovat na membránové signály, především u již zmíněného povrchového membránového receptoru smrti Fas. Navíc zvýšení cirkulující solubilní formy Fas kompetitivně inhibuje vazbu Fas ligandu na receptor a signál k iniciaci apoptotické kaskády v lymfocytech nemocných nevzniká. Inhibice apoptózy je mechanismem odpovědným za proliferaci a akumulaci lymfocytů.

Stimulace apoptózy a neurodegenerativní onemocnění
Také porušená regulace apoptózy ve smyslu urychlené buněčné smrti vede k řadě klinicky významných onemocnění (tab. 1). Pravděpodobně nejzávažnější z pohledu gerontologie je skupina neurodegenerativních chorob, které ve stáří postihují více než 10 % populace (Alzheimerova choroba 7-10 %, Parkinsonova choroba 1-3 %, ostatní méně než 1 %). Pro tato onemocnění je charakteristické, že probíhají dlouhodobě, mají vysoký invalidizující potenciál a infaustní prognózu a pro vysokou a dlouhotrvající potřebu péče jsou ekonomicky nákladné.
Neurodegenerativní onemocnění jsou charakterizována pokračující ztrátou specifických skupin neuronů, které zanikají mechanismem apoptózy. Přesný patogenetický mechanismus u jednotlivých onemocnění není znám, avšak uplatňuje se jistě jak vnitřní, tak zevní cesta indukce apoptotického zániku nervových buněk. Předpokládá se vyšší citlivost stárnoucích neuronů na zevní noxy (oxidativní stres, toxické postižení, chronická hypoxie). Mezi fyziologické aktivátory apoptózy v mozku patří i glukokortikoidy, kalcium a některé neuromediátory (glutamát, dopamin, N-metyl-D-aspartát). V této souvislosti byla studována i role beta-amyloidu, který se zvýšeně akumuluje ve stárnoucích mozcích a v patologickém množství především v mozku nemocných s Alzheimerovou chorobou. Jednoznačně byl prokázán indukční efekt beta-amyloidu na apoptotické děje a vyšší ztráta neuronů mechanismem programované buněčné smrti.

Významná invalidita je s narůstajícím věkem způsobena kardiovaskulárními chorobami. Především v posledních 10 letech byly získány nové poznatky o možném vztahu apoptózy a nejčastějších kardiovas-kulárních chorob - aterosklerózy, ischemického postižení srdce, srdečního selhání, srdeční hypertrofie a kardiomyopatie. Nejvíce poznatků existuje o regulaci apoptózy u hypertrofie myokardu a cévní stěny (inhibice apoptózy) a při následné remodelaci myokardu při úspěšném snížení tlakové a objemové zátěže (stimulace apoptózy). Pravděpodobný je i přímý vliv některých z běžně užívaných léků.

Léky jako modulátory programované buněčné smrti

Velmi lákavá je představa možného ovlivňování apoptózy farmakologicky. Potenciál některých farmak (cytostatik, hormonů) užívaných v onkologii již léta k zabránění růstu nádorů byl osvětlen teprve v posledních letech. Mechanismem jejich účinku je indukce apoptózy v nádorových buňkách. Několik dalších skupin farmak bylo sledováno v experimentu nebo klinickém výzkumu a jejich závěry shrnuje tabulka 2. Slibné se zdají i pokusy s inhibitory kaspáz. Dosud však jsou naše znalosti v této oblasti nedostatečné. Již dnes se zdá, že farmakologická modulace procesů apoptózy bude v blízké budoucnosti jednou z cest pro léčbu nádorů i pro ovlivnění orgánové atrofie spojené se stárnutím.

Geriatrická klinika
1. LF UK, Praha
Subkatedra geriatrie
a gerontologie IPVZ, Praha

Doplňující literatura
(přehledné články)
1. Hengartner M. O.: The biochemistry of apoptosis. Nature, 407, 770-776, 2000
2. Horký K.: Patofyziologický význam apoptózy u kardiovaskulárních onemocnění. Cor Vasa 42, (1), 31-34, 1999
3. Chaloupka J.: Adaptace a programovaná smrt - dvě odpovědi buňky na poškození. Jejich vzájemný vztah a význam pro přežití buněčných populací a organismů za stresových podmínek. Biologické listy 64 (2), 81-102, 1999
4. Joaquin A. M., Gollapudi S.: Functional decline in aging and disease: A role of apoptosis. JAGS 49,1234-1240, 2001
5. Novosad J., Kodydková K., Krejsek J.: Apoptóza, její mechanismy a medicínský význam. I. Definice apoptózy a její průběh na buněčné úrovni a II. Poruchy regulace apoptózy a jejich souvislost s rozvojem onemocnění. Vnitřní lékařství 47 (6), 381-390, 2001